共聚焦显微镜是一种利用点光源照射、点探测器接收，并通过共轭针孔消除离焦光干扰的高分辨率光学成像技术。它突破了传统宽场荧光显微镜的分辨率限制，尤其擅长三维成像、光学切片和活细胞动态观测，是生命科学、材料科学等领域的重要工具。
一、核心原理：共轭聚焦与光学切片
1.点照明： 激光光源发出的光束通过照明针孔，聚焦成非常小的点照射到样本的特定焦平面上的一个点。
2.点探测： 样本被激发产生的荧光(或反射光)信号，只有来自焦平面的信号才能精确地通过探测针孔到达探测器(通常是光电倍增管PMT或雪崩光电二极管APD)。
3.消除离焦光： 来自样本非焦平面(上方或下方)的散射光或荧光信号，在通过探测针孔时会被阻挡，无法到达探测器。这就是共轭针孔(照明针孔和探测针孔共轭) 的核心作用。
4.扫描成像： 为了获得整幅图像，聚焦的激光点需要通过扫描振镜系统在样本的X-Y平面上进行逐点扫描。探测器在每个扫描点同步记录光强信号。
5.光学切片： 通过精确控制物镜的Z轴位置(上下移动样本或物镜)，可以在样本的不同深度获取一系列清晰的二维图像(X-Y平面图像)。这些图像被称为光学切片。
6.三维重建： 将采集到的一系列光学切片通过计算机软件进行叠加和处理，即可重建出样本的高分辨率三维结构。
二、关键组件
1.激光光源： 提供高强度、单色性好、方向性好的激发光。通常配备多个不同波长的激光器，用于激发不同的荧光染料。
2.扫描装置：
扫描振镜： 核心部件，通常是两个高速振动的反射镜(X轴和Y轴)，精确控制激光束在样本表面的扫描路径。
扫描透镜与管透镜： 确保扫描光束精确聚焦在物镜的后焦面，实现无畸变扫描。
3.分光镜/二向色镜： 将激发光反射到样本方向，同时允许样本发射的荧光透射到探测光路。需要根据所用荧光染料的激发和发射光谱选择合适的镜片。
4.物镜： 高质量、高数值孔径(NA)的物镜至关重要，它决定了系统的分辨率、光收集效率和成像深度。
5.共轭针孔：
照明针孔： 位于光源后，将激光变成点光源。
探测针孔： 位于探测器前，阻挡离焦光。针孔大小可调，是控制光学切片厚度和图像信噪比的关键参数(小针孔切片薄、分辨率高但信号弱；大针孔切片厚、信号强但分辨率降低)。
6.探测器： 通常是高灵敏度的光电倍增管或雪崩光电二极管，将微弱的光信号转换为电信号。
7.计算机控制系统： 控制扫描、Z轴移动、激光强度、针孔大小、探测器增益、图像采集和处理等所有参数。
8.荧光滤光片组： 位于探测光路中，进一步阻挡残留的激发光和其他波长的杂散光，确保探测到的是特定发射波长的纯净荧光信号(发射滤光片)。
三、主要优势
1.高轴向分辨率(Z分辨率)与光学切片能力： 这是突出的优势。能清晰区分样本中不同深度的结构，获得样本内部不同层面的清晰图像，无需物理切片即可进行三维成像。
2.高对比度： 有效抑制离焦背景光干扰，显著提高图像的清晰度和信噪比，特别适合观察厚样本或弱荧光信号。
3.高分辨率： 相比传统宽场荧光显微镜，共聚焦显微镜的X-Y平面分辨率也有一定提升(约1.4倍)，尤其在利用某些技术后分辨率可接近光学衍射极限。
4.三维重建： 可对活体或固定样本进行非侵入性的三维结构解析。
5.多通道成像： 可同时或依次使用不同波长的激光激发不同的荧光标记物，实现多色标记样本的多通道成像，研究不同分子或结构的共定位。
6.活细胞成像： 减少光毒性和光漂白(相对于宽场需要更短的曝光时间获取清晰图像)，结合合适的培养系统，可用于长时间观察活细胞内的动态过程。
7.图像后处理： 强大的软件支持进行三维可视化、表面渲染、体积测量、共定位分析、荧光强度定量分析等。
四、主要应用领域
1.细胞生物学：
细胞器结构与动态(线粒体、内质网、高尔基体、细胞骨架)。
细胞膜结构与流动性。
细胞内离子浓度(如Ca²⁺, pH)成像。
基因表达与蛋白定位。
细胞间相互作用(如免疫突触)。
细胞迁移与分裂。
2.神经科学：
神经元形态与树突棘结构。
神经网络连接。
突触结构与功能。
神经递质释放与受体分布。
3.发育生物学： 胚胎发育过程的三维形态发生、基因表达模式。
4.病理学与临床诊断：
组织病理学切片分析(提供比普通光镜更丰富的亚细胞信息)。
皮肤科在体共聚焦显微镜用于无创诊断皮肤病(如黑色素瘤)。
5.免疫学： 免疫细胞激活、迁移、与靶细胞的相互作用。
6.微生物学： 细菌、真菌在宿主细胞内的生存、生物膜结构。
7.植物学： 植物细胞结构、细胞壁、叶绿体、基因表达。
8.材料科学： 材料表面形貌、涂层厚度、薄膜结构、微电子器件检测、高分子材料结构等(常使用反射模式)。
