共聚焦显微镜是一种通过空间针孔滤波技术实现光学切片的高分辨率显微成像设备。与传统宽场显微镜相比，其分辨率提升约1.4倍，可生成样本内部的三维重构图像。
一、核心原理
1点照明 & 点探测
激光束聚焦为微小光点(衍射极限级)照射样品。
发射光(荧光/反射光)通过针孔，仅允许焦平面信号通过探测器，阻挡离焦背景光。
2光学切片
通过逐点扫描样品平面，并逐层移动聚焦位置，获得系列二维薄层图像。
叠加所有切片可重建三维立体结构。
二、 共聚焦显微镜核心优势
1.出色的光学切片能力与三维重建：
消除非焦面模糊，获得样品内部特定深度的清晰图像。
通过Z轴步进扫描，获取一系列二维“光学切片”，经计算机处理可精确重建样品的三维结构。这是研究细胞器空间分布、组织形态、材料表面/内部结构的基石。
2.高分辨率与高对比度：
X-Y分辨率接近光学衍射极限(~200 nm)，Z轴分辨率(~500 nm)显著优于宽场显微镜(~1000-2000 nm)。
“针孔效应”极大抑制背景噪声，提升图像信噪比(SNR)和对比度，尤其对厚样本或弱荧光信号至关重要。
3.强大的多色荧光成像能力：
利用多种不同激发波长的激光器和精密的荧光分光探测系统(如声光可调滤光器AOBS， 二向色镜， 光谱探测器)，可同时对同一样品中的多个不同标记物进行成像。
高级光谱拆分技术(线性拆分)可有效分离发射光谱高度重叠的荧光染料，实现更精确的多色分析。
4.活细胞成像工具：
点扫描(尤其共振扫描)和转盘共聚焦为观察活细胞内快速、动态的生理过程提供了可能。
结合环境控制系统(温控、CO₂、湿度)，可在接近生理条件下对细胞进行长时间(数小时甚至数天)观察，研究细胞迁移、分裂、信号转导、药物反应等。
5.定量分析平台：
荧光强度定量分析(如蛋白表达量、离子浓度变化)。
共定位分析(研究分子间的空间关系)。
荧光漂白后恢复(FRAP)及其变种：研究分子流动性、相互作用、细胞器连通性。
荧光共振能量转移(FRET)：检测分子间相互作用距离(<10 nm)。
荧光寿命成像(FLIM)：提供分子微环境信息(如pH、离子浓度、分子结合状态)，是定量FRET的重要手段。
荧光相关光谱(FCS)/荧光互相关光谱(FCCS)：在极微小体积内分析分子扩散系数、浓度、相互作用。
三、核心组件与技术
1.激光光源：
多谱线激光器： 提供多个固定波长的激发光(如405nm, 488nm, 561nm, 640nm)。
白光激光器(WLL)： 提供连续可调的激发波长，极大提升实验灵活性。
飞秒/皮秒激光器： 用于多光子激发。
2.扫描系统：
振镜扫描器： 核心组件，控制激光束在X-Y方向精确扫描。
共振扫描器： 用于高速扫描。
转盘扫描器： 用于转盘共聚焦。
3.探测系统：
光电倍增管(PMT)： 传统探测器，灵敏度高。
混合探测器(HyD)： 结合PMT高增益和雪崩二极管(APD)高量子效率、低噪声。
雪崩光电二极管(APD)： 速度快，用于FLIM/FCS等。
科学级sCMOS相机： 用于转盘共聚焦、光片、宽场超分辨。
4.分光系统：
声光可调滤光器(AOTF)： 快速、精确调节激光强度和波长。
声光分束器(AOBS)： 利用声光效应进行高效、快速、无串扰的分光(替代二向色镜，徕卡TCS核心)。
二向色镜/滤光片轮： 传统分光元件。
光谱探测器： 收集发射光的光谱信息，用于光谱拆分。
5.精密物镜：
高数值孔径(NA)油镜、水镜、甘油镜、硅油镜、空气镜。
复消色差(APO)物镜。
长工作距离(WD)物镜。
专用物镜(如活细胞专用、多光子专用、TIRF专用)。
6.软件平台：
核心控制： 硬件控制(激光、扫描、探测、载物台、Z轴)、图像采集。
图像处理与分析： 去噪、反卷积、3D/4D可视化、定量分析(强度、共定位、形态、FRAP、FRET、FLIM、FCS等)。
实验管理： 多维实验、宏编程、自动化。
四、 共聚焦显微镜应用领域
1.生命科学研究：
细胞生物学： 细胞器结构与动态(线粒体、内质网、高尔基体、溶酶体、细胞骨架)、细胞分裂、细胞迁移、囊泡运输、信号转导、细胞间通讯。
神经科学： 神经元形态(树突棘、轴突)、突触结构与功能、神经回路、钙成像、神经递质释放。
发育生物学： 胚胎发育、组织形成、器官发生(活体成像)。
免疫学： 免疫细胞迁移、免疫突触形成、病原体-宿主细胞相互作用。
微生物学： 细菌/真菌形态、生物膜结构、病原体侵染过程。
药理学与药物开发： 药物靶点定位、药物细胞内分布、药效评估(如细胞凋亡、增殖)、高通量筛选(转盘共聚焦)。
2.临床医学：
病理学： 组织切片的高分辨率、高对比度成像(尤其荧光标记的特定蛋白或核酸)，辅助诊断。
眼科： 角膜、视网膜成像。
辅助生殖： 胚胎质量评估(非侵入性)。
3.材料科学：
表面形貌与粗糙度分析： 高精度三维表面成像。
薄膜与涂层分析： 厚度测量、均匀性、缺陷检测。
聚合物科学： 相分离结构、结晶形态、添加剂分布。
半导体与微电子： 器件结构、线路检查、缺陷定位。
地质与矿物学： 矿物成分分布、孔隙结构分析。
法医学： 微量物证(纤维、油漆、粉尘)的精细结构观察和成分分析。
